海洋光学亚洲 市场部05 十二月 2022
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- 荧光
激发光与物质作用，产生与激发光不同波长、或者不同频率的光，这就是荧光。当一个短波长的激发光在一点激发物质，我们就能在物质发散的其他位置观察到比激发光更长波长的光。
当某种物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。
荧光测量
荧光激发光谱可以通过有效的荧光激发波长来展示，并能看出荧光转化效率。大多数情况下，激发波长和物质的发射波长会发生重叠，但是如果非常了解荧光机理，不难判断出长波为荧光发射波长，短波段为激发波。
图1. 激发波长和发射波长重叠现象
模块化光谱仪，激发光源和其他附件的搭配，可以使客户自由根据自己的需求搭配适合参数的荧光测量系统，同时海洋光学提供的配件可以轻松让客户在吸光度和荧光测量间随意切换，模块化光谱仪的多样应用和优越性完美体现。
光谱仪
图2. 高灵敏度，背照减薄型CCD光纤光谱仪
鉴于荧光的特性，海洋光学提供高灵敏度光谱仪QE Pro系列供荧光检测使用，两者检测器同为背照减薄型CCD，QE Pro还带有CCD制冷，所以信噪比上更具有优越性。
海洋光学提供的荧光和吸光度模块化测量系统，非常便于在吸光度和荧光测量之间进行切换，客户只需要将光纤和比色皿支架的连接位置进行更改，就可以实现两种不同原理的测量。下图为吸光度测量的典型配置方案，客户可以根据自身的需求选择不同模块的光谱仪，高灵敏度的QE Pro，高性价比的Flame系列，而且光谱仪的可更换狭缝还可以根据客户的需求自行更换（吸光度测量可以使用小狭缝的光谱仪，荧光相对于是比较弱的发射光，可以选择使用更大狭缝的光谱仪）。
另外，模块化的光谱仪更易根据客户的需求更改激发光源，激光器或者LED都可以。如果使连续光源，客户可以使用滤光片将连续光源过滤成单色光进行荧光测量，具体型号可以参考图3。
为了判定未知荧光物质的激发波长，我们推荐客户先选择使用可自行更换狭缝的QE Pro-ABS光谱仪（也可以使用Flame系列光谱仪）。
比色皿支架也可以先选择CUV-ALL-UV四通道的支架，180°的连接可以实现吸光度测量，90°的连接可以进行荧光测量。CUV-ALL-UV内置了滤光片卡槽，客户可以自行将滤光片调节好后放置到比色皿支架上，实现吸光度装置完成荧光测量。另外，客户也可以将连续光谱光源更换成LED光源（比如LLS-365，LLS-470）。
| 吸光度/荧光测量系统 | |
| 光谱仪 | QE Pro-ABS高灵敏度光谱仪（200-950nm） |
| 光源/激发光源 | LLS-365 and LLS-470 LEDs for excitation LLS-365/LLS-470LED激发光源 |
| 光纤/探头 | QP600-2-VIS-NIR 光纤，两根 |
| 附件 | CUV-ALL-UV比色皿支架，另加74-MSP反射镜 |
| INTSMA-200可更换狭缝；LVF-KIT滤光片套件 | |
| 软件 | OceanView操作软件 |
| 样品 | 未知荧光物质 |
激发光源
激发光源的选择很多样，比如LED光源、激光等等。如果您选择使用LED，那LED的中心波长最好接近激发光源波长；如果您选择激光，激光的强度最好要能被光谱仪检测到，才能保证发射荧光能被检测到。如果选择使用带宽光源（即连续光谱光源）作为激发光，我们可以使用单色滤光片滤出单色光。
尽管荧光物质的激发波长与其吸收波长不一致，但是一般情形下我们可以通过简单的吸光度测试来判断荧光物质的激发波长。当我们对比吸光度光谱和发射光谱时，大多数情况下还是很类似的，只是相对强度会有差异。
可选滤光片
带通滤光片是窄化激发光源的最简单选择，该滤光片由长通和短通两块滤光片组成，通过调节短通滤光片的位置，可以实现单色激发光。
图3 可调中心波长线性带通滤光片
如果未知荧光物质的激发波长，我们推荐客户使用可调线性滤光片，比如海洋光学的产品LVF-HL，客户可以自行通过调节滤光片找到最适合的激发波长。可调式的带通滤光片，可以设置带宽20nm到100nm不等的单色波，还可以单独使用长通和短通滤光片，设置起始波长和截止波长。
采样附件
标准荧光测试系统采用与激发光90°角的位置接收荧光，这样的收光方式最大程度上减小了透射光与散射光的影响。
模块化的荧光测量系统最大的优点在于在使用单个激发光源和检测器的情况下，它能最快、最简单地、最快速递获得即时数据。通过改变光纤的连接位置，可以实现0°, 90°和180°的不同收光角度，从而对样品进行不同形式的光学测量。另外，我们还可以选择可浸入式的探头，或者可调节带宽光学滤光片，针对不同的应用环境进行荧光测试。下面就介绍一下海洋光学可提供的配件选择：
图4. 配有准直透镜的比色皿卡槽（CUV-ALL-UV），可实现90°的荧光测量和透过型吸光度测量
CUV-ALL-UV比色皿卡槽，更换其中的透镜为74-MSP可以提高样品荧光的聚集。另外使用Fluoro Vettes比色皿，由于其在紫外段的极好透过率和其微量（50uL）容积，可以简便高效率地实现nmol浓度物质的荧光测量。
CUV-FL-DA配有海洋光学的光源和4通道的比色皿卡槽，由于其不使用光纤耦合而是空间耦合的方式，大大提高了耦合效率。
如果需要测量高浓度的液体样品、固体或者粉末，荧光反射探头是比较理想的选择。使用荧光反射探头，可以直接接触样品表面，获取样品的荧光散射光。另外可以通过使用滤光片过滤激发光，使荧光散射光谱更明显 。
对流动的样品进行荧光测量，可以使用荧光测试流通池，可以随时监控荧光样品的反应过程及整个状态。
实验
为了确定样品的确定激发波长，我们可以先对样品进行吸光度测量。使用QE Pro-ABS，比色皿支架和卤钨灯。QE Pro-ABS使用10um狭缝配置，非常适合于吸光度测量。使用OceanView的吸光度操作包，完成简单的吸光度测量。
一旦你获得了未知荧光物质的吸光度光谱，我们就能判断该物质的激发波长大概的范围，从而判断该物质产生荧光的最有效激发波长，再去购买最合适的LED激发光源。
上图为典型的荧光测量搭建图，四通道的CUV-ALL-UV可以根据测试需求自行更改。吸光度测量时，可以在180°位置使用两个74-UV（准直镜）；荧光测量时，90°位置使用两个74-UV，另外另个通道使用74-MSP反射镜，增加可接收的荧光信号。
软件的使用
新版OceanView软件可以让使用者更好地使用光谱仪进行各种应用。当使用OceanView进行荧光测量时，经常使用到两种测量模式：QuickView mode（快速扫描）和Relative Irradiance mode（相对辐射）。
快速扫描模式可以显示每个像素点的原始光强，而不进行任何处理步骤或者光谱仪强度校准等。我们需要铭记的是，由于每台光谱仪的单个原件和检测器的不一样，导致每台光谱意义的感光强度也就不一样，所以使用者容易被快速扫描模式误导，发现显示的光谱数据与理论数据（参考论文文献等的数据）有差，特别是光谱形状和中心波长等等，所以这时候就需要使用相对辐射或者绝对辐射模式。
相对辐射模式下，仪器的响应可以通过已知色温值的标准光源在进行标定，卤钨灯作为一种典型的已知色温值的标准光源，可以用于可见到近红外波长范围。相对辐射测量能对光谱仪进行相对强度校准。
但是相对辐射校准能满足于荧光测量吗？并不是 。使用单个光谱仪进行测量是相对精确的，您可以对荧光发射峰与其他峰的比值进行计算，从而得出相对比较准确的荧光强度数值。
当我们使用不同光谱仪进行荧光测量时，使用相对辐射是非常重要的，通过相对辐射测量可以判断光谱形状，光谱的位置及偏移等等。
总结
传统的荧光测量系统相对比较不灵活，也比较局限于实验室使用。而模块化的光谱仪能灵活应用于荧光测量，选配不同的附件和采样装置，能实现多种搭配，这些是传统荧光测量系统不能比的。