吸光度线性度有多重要?

吸光度线性度有多重要?

高性能吸光度线性度的光谱仪一直局限于那些复杂且昂贵的仪器。现在,像Ocean ST这样更简单、更容易使用的光谱仪正在实现类似的测量结果。

在这篇应用中,我们评估了用于蛋白质和DNA测量的微型Ocean ST光谱仪的吸光度线性度。Ocean ST是一款最近发布的光谱仪,它紫外响应出色(185-650 nm)、信噪比高和体积小(小于智能手机)。

注: Dr. Yvette Mattley 提供了这篇应用素材。

背景

为什么要测吸光度?因为吸光度测量提供了有关材料化学成分的有价值的信息。入射到样品上的光可以被透射、吸收或散射。透射是光穿过样品,遇到分子的光被吸收或散射。吸光度可作为定性工具来识别物质,也可作为定量工具来测量溶液中分子的浓度。

吸光度是一项重要的技术,应用范围广泛,特别是在生物医学和生命科学领域,研究人员、开发人员和工艺工程师将吸光度技术应用于从蛋白质分析到POC旁床诊断等。

吸光度线性度

光谱仪测量精度的一个指标是其吸光度线性度。如比尔定律所述,给定波长吸收光的溶液将在该波长产生吸收峰,其强度随着溶液浓度的变化而线性变化。例如,如果溶液浓度加倍,吸光度峰的高度也会加倍。因此,当我们描述光谱仪具有2 AU(吸光度单位)的吸光度线性时,这表明超过2 AU,样品浓度与吸光度峰值之间的关系就失效了(不再是线性的)。这与很多因素有关,包括探测器噪声和杂散光。

具有高吸光度线性度的光谱仪允许用户1)在较宽的浓度范围内准确测量样品 2)无需对高度复杂的样品稀释,反复稀释在测量过程中存在引入误差的风险。这对于需要非常高测量精度的应用来说是至关重要的,当您想要比较一个实验与下一个实验的结果,或者当您只有有限数量的样本时。

基于Ocean ST检测蛋白质和DNA的吸光度

为评估Ocean ST的吸光度线性度,我们测量了牛血清白蛋白(BSA)和DNA寡核苷酸。牛血清白蛋白是一种常用于生化应用的蛋白质,而寡核苷酸合成DNA或RNA,广泛应用于基因检测和医学诊断等众多领域。

设备搭建

我们使用Ocean ST-UV (185-650 nm),积分时间设置为3.8 ms,扫描平均为100,滑动平均设置为3。打开暗光谱存储和非线性校正。测量前对光谱仪和光源加热30分钟,以确保热稳定性。

下面是其他设备:

  • DH-2000-S-DUV-TTL 深紫外氘卤钨光源。在这些实验中,我们只用了氘灯。所有测量时卤素灯都是关着的。
  • SQ1-ALL 比色皿支架。这是一个通用的1厘米光程的比色皿支架。
  • CV-Q-10 1 cm (10 mm) 光程石英比色皿。石英比色皿是紫外测量应用的绝佳选择。 
  • QP450-1-XSR 抗紫外老化光纤(数量2)。450 μ m 芯径光纤,不锈钢BX护套。

样品制备和测量

我们测量了30个BSA (Sigma A2153),浓度范围为0.02至5 mg/mL;35个寡核苷酸DNA (Sigma D-3159)浓度范围为0.3至150µg/mL。所有稀释都是直接在石英比色皿中进行的,从试管中取出0.5 mL样品,向比色皿中加入0.5 mL蒸馏水,然后通过轻轻地将样品移进和移出3次来混合样品。在测量过程中,石英比色皿没有从比色管支架上取下,这有助于最大限度地减少由污染物或比色皿对齐问题引起的误差。

实验结果

BSA的吸光度测量显示其吸光度与2 AU呈线性关系,超出了我们对Ocean ST的预期(图1)。这非常有意义,因为BSA是一种典型的蛋白质,应用于许多领域如生命科学研究和开发。

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图1. Ocean ST微型光谱仪在较宽的蛋白质浓度范围内显示出显著的吸光度线性度。

通过Ocean ST对DNA寡核苷酸的测量,也获得了同样令人印象深刻的吸光度线性度结果(图2)。这表明了Ocean ST对低聚物研究的价值,低聚物作为许多分子生物学研究和开发工作的起点。对于定制低聚物生产也很有价值,紫外可见光谱被用作制造过程中量化的步骤。

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图 2. Ocean ST微型光谱仪所显示的吸光度线性度通常与更复杂的光谱仪有关。